TESTE COM A MEMBRANA CÓRIO-ALANTÓIDE (HET-CAM)

A membrana corioalantóide (MCA) do ovo de galinha é uma estrutura muito vascularizada, utilizada pelo embrião para trocas gasosas através da casca do ovo. Sua característica estrutural faz com que seja considerada similar aos tecidos altamente vascularizados como a conjuntiva, sendo capaz de responder frente a produtos irritantes. Estas características permitem que o método seja uma boa alternativa ao método clássico de Draize. O método utilizado corresponde a uma modificação do método descrito por Luepke (1985), para o ensaio do potencial irritante e corrosivo, permitindo o estudo dos efeitos imediatos das substâncias sólidas ou líquidas na membrana do ovo de galinha embrionado.

Esse método é validado internacionalmente, aceito pela legislação francesa e indicado pela ANVISA na avaliação da segurança de produtos cosméticos e farmacêuticos (VINARDELLI & GARCÍA, 2000; MURILLO et al., 2003; MARUNO, 2009; CAZEDEY et al., 2009).

O objetivo do ensaio é avaliar semi-quantitativamente o potencial irritante de um produto (produtos solúveis, emulsões, géis e óleos), sobre a membrana corioalantóide de ovo embrionado de galinha, no décimo dia de incubação. O ensaio é baseado na observação dos efeitos irritantes (hiperemia, hemorragia e coagulação), após 5 minutos da aplicação do produto, puro ou diluído, sobre a membrana corioalantóide. Obtém-se uma escala que considera os fenômenos observados (GUIA DE AVALIAÇÃO DE SEGURANÇA DE PRODUTOS COSMÉTICOS, 2003).

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Referências

ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária). Guia de Estabilidade de Produtos Cosméticos, Brasília, 2004.

CAZEDEY, E.C.L.; CARVALHO, F. C.; FIORENTINO, F.A.M.; GREMIÃO, M.P.D.; SALGADO, H.R.N. CORROSITEX, BCOP AND HET-CAM as alternative methods to animal experimentation. Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences, v. 118, p. 759-766, 2009.

GUIA PARA AVALIAÇÃO DE SEGURANÇA DE PRODUTOS COSMÉTICOS. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. P. 24, 2003.

Kalweit, S., Besolke, R., Gerner, I. & Spielmann, H. (1990) A national validation project of alternative methods for the Draize rabbit eye test. Toxic. in Vitro, 4, 702-706.

LUEPKE, N.P. Hen’s egg choriallantoic membrane test for irritation potencial. Food and Chemical Toxicology, v. 23, p. 287-291, 1985.

Lüpke, N.P. (1986) HET (Hen's Egg Test) in Toxicological Research. In: Skin Models. Models to Study Function and Disease of Skin (eds. Marks, R. & Plewig, G.). Published by Springer-Verlag, pp 282-291.

MARUNO, M. Desenvolvimento de nanoemulsões à base de óleo de gergelim aditivadas de óleo de framboesa para queimaduras da pele. Tese de doutorado. Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2009.

MURILLO, G.; PEREZ, U.; TUR, E.; VINARDELL, M. P.; GARCÍA, G.; PASCUAL, J.R. Estúdio comparativo de três variantes Del ensayo de La membrana corioalantoidea Del huevo de La Galina para La evaluación de La irritacíon ocular. Revista de Toxicologia, v. 20, p. 187-192, 2003.

Spielmann, H., Gerner, I., Kalweit, S., Moog, R., Wirnsberger, T., Krauser, K., Kreiling, R., Kreuzer,H., Lupke, N.P. Miltenburger, H.G. Muller, N. Murmann, P. Pape, W. Siegmund, B. Spengler, J. Steiling, W. & Wiebel, F.J. (1991) Interlaboratory assessment of alternatives to the Draize eye irritation test in Germany. Toxic. in Vitro, 5 No.5/6, 539-542.

VINARDELL, M. P.; GARCÍA, L. The quantitative choriallantoic membrane test using trypan blue stain to predict the eye irritancy of liquid scintillation cocktails. Toxixology In Vitro, v. 14, p.551-556, 2000.

ENSAIO DE FOTOTOXICIDADE E CITOTOXICIDADE

O teste de fototoxicidade in vitro utilizando fibroblastos 3T3 NRU e queratinócitos humanos (inovação) é realizado para identificar o potencial fototóxico de substâncias, o qual é induzido pela excitação química através da exposição à luz.

A proliferação celular e/ou toxicidade in vitro são estabelecidas por meio de curvas dose-resposta obtidas pelo ensaio colorimétrico de viabilidade celular – MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)2,5-difeniltetrazolio brometo]. O ensaio de MTT consiste na detecção do crescimento celular/morte celular, de acordo com a capacidade da mitocôndria em converter o sal de tetrazólio MTT em um produto de coloração roxa que pode ser medido espectrofotometricamente. O princípio deste método consiste no fato de que células vivas, em crescimento, têm mitocôndrias competentes promovendo a respiração celular, liberando no meio, espécies redutoras provenientes da cadeia respiratória (NADPH) que reduzem o sal MTT amarelo no produto corado roxo - formazan. Já as células mortas, ou em processo de morte celular, têm a função mitocondrial comprometida, não ocorrendo a produção dos sais de formazan. Este ensaio é empregado para o estudo de produtos de base aquosa em cultura celular de fibroblastos provenientes de derme da linhagem NIH-3T3 e queratinócitos humanos provenientes de amostras de pele humana.